多孔磷酸钙颗粒对维生素C的负载及其可控释放

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.020

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
维生素C：是一种水溶性维生素，可被用作抗氧化剂来消除导致皮肤老化的氧化剂和自由基，也可减少DNA被氧化损坏并促进DNA修复，还有抗癌作用等。近来有报道指出，维生素C是刺激细胞合成胶原蛋白的必备物质，可调节碱性磷酸酶的活性及蛋白的合成，可诱导、加速骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，促进骨的修复和再生。但维生素C水溶液不稳定，对气氛、水分、光、热和氧气等非常敏感，可迅速被氧化而引起变质、失效，因此在其使用时需要载体材料的保护。
磷酸钙：具有与骨相似的化学成分、良好的生物相容性和极强的吸附能力而成为备受关注的骨相关药物载体材料。为了实现不同的治疗目标，已有多种具有不同形状和尺寸的磷酸钙材料被合成出来，用于药物的负载、保护和缓释。

背景：近来有报道指出，维生素C可诱导、加速骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，促进骨的修复和再生，但维生素C水溶液不稳定，因此在其使用时需要载体材料的保护。
目的：将磷酸钙作为维生素C的载体，观察其对维生素C的包载及控释能力。
方法：采用化学沉淀法制备负载维生素C的磷酸钙颗粒，使维生素C终浓度分别为0，0.1，2，4 mmol/L，检测颗粒载药量。将负载维生素C的磷酸钙颗粒置于模拟体液中，检测维生素C释放量；同时检测超声环境下的维生素C释放量。将磷酸钙颗粒、负载2 mmol/L维生素C的磷酸钙颗粒与MC3T3-E1细胞共培养，1，3，5，7 d后检测细胞增殖，1，5，10，15 d后检测细胞碱性磷酸酶活性。
结果与结论：①负载0.1，2，4 mmol/L维生素C磷酸钙颗粒的载药量分别为(59.9±5.4)%、(87.2±1.2)%及(28.4±26.3)%；②在正常环境下，负载0.1，2 mmol/L维生素C的磷酸钙颗粒前期释放速率较慢，负载4 mmol/L维生素C的磷酸钙颗粒前期释放速率较快，3种样品都有持续释药的特点；③在超声环境下，负载2 mmol/L维生素C的磷酸钙颗粒存在一定的突释现象，第1次释放量为5%-15%，而随后的释放速度较缓慢；在75，105和150 W超声辅助条件下，分别持续释放了220，340，260 min；④负载2 mmol/L维生素C的磷酸钙颗粒对MC3T3-E1细胞的增殖无影响，但提高了细胞的碱性磷酸酶活性；⑤结果表明，磷酸钙可作为维生素C的载体。

ORCID: 0000-0002-0125-7305(祝永强)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 缓释材料, 磷酸钙, 药物载体, 维生素Ｃ, 超声化学法, 可控释放

Abstract:

BACKGROUND: It is reported that vitamin C can induce bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts, and promote bone repair and regeneration. However, vitamin C solution is unstable, so a carrier is necessary.
OBJECTIVE: To observe the loading and controlled-release abilities of calcium phosphate used as the carrier of vitamin C.
METHODS: Calcium phosphate particles loaded with vitamin C were fabricated using chemical precipitation method, and the final concentration of vitamin C was 0, 0.1, 2 and 4 mmol/L, respectively. The drug-loaded capacity was detected. The release of vitamin from calcium phosphate nanoparticles in the simulate body fluid and ultrasonic environment was respectively evaluated. MC3T3-E1 cells were co-cultured with calcium phosphate nanoparticles loaded with 2 mmol/L vitamin C, or calcium phosphate nanoparticles only. The cell proliferation was detected at 1, 3, 5 and 7 days of culture, and the alkaline phasphatase activity was detected at 1, 5, 10 and 15 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: The drug-loaded contents of calcium phosphate nanoparticles loading 0, 0.1, 2 and 4 mmol/L vitamin C were (59.9±5.4)%, (87.2±1.2)% and (28.4±26.3)%, respectively. Under normal environment, all samples could release vitamin C persistently, but the initial release speed of the particles carrying 0.1 and 2 mmol/L vitamin C was lower than that of particles carrying 4 mmd/L vitamin. Under ultrasonic environment, 2 mmol/L vitamin C-loaded calcium phosphate particles exhibited a quick release speed firstly that reached 5-15%, followed by a slow release speed. When ultrasonic powers kept at 75, 105 and 150 W, the release duration of vitamin C was 220, 340 and 260 minutes, respectively. MC3T3-E1 cell proliferation did not change after co-cultured with 2 mmol/L vitamin C-loaded calcium phosphate particles but the alkaline phosphatase activity was improved. These results suggest that calcium phosphate particles can be used as the carrier of vitamin C.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium phosphates, Drug carriers, Asorbic Acid, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孔军，祝永强. 多孔磷酸钙颗粒对维生素C的负载及其可控释放[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 273-279.

Kong Jun, Zhu Yong-qiang.

Controlled release of porous calcium phosphate nanoparticles loaded with vitamin C

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(2): 273-279.

图/表（结果） 6

2.1 X射线衍射分析结果采用X射线衍射分析载药颗粒和纯维生素C的成分，结果见图1所示，谱图上的2个主要衍射峰(2θ为25.9°，31.8°)分别对应于羟基磷灰石(JCPDS09-432)的(002)和(211)晶面，表明所得颗粒的无机相为羟基磷灰石。颗粒的衍射峰较少，而且宽化，说明得到的颗粒结晶度较差。实验中所用维生素C的X射线衍射结果与维生素C标准卡(JCPDS22-1560)一致，证明其为高纯度的维生素C粉末。但在载药颗粒的X射线衍射曲线上没有明显的维生素C衍射峰出现，主要是由于在本实验条件下，维生素C含量较少(<2%)所引起的。

2.2 场发射扫描电子显微镜观察结果超声条件下，未加维生素C制备的颗粒呈球状(图2a)，样品表面光滑，直径约为100 nm。0.1VC-CPSs和2VC-CPSs样品尺寸比4VC-CPSs样品(图2b-d)，前两者的颗粒直径在100-200 nm之间，样品表面光滑，这可能是维生素C在表面附着的原因。4VC-CPSs样品颗粒则为疏松多孔的大颗粒，直径约为 1 μm。在颗粒孔道中可见被负载的维生素C(图2d)。

2.3 比表面积和孔径分布检测结果样品的比表面对药物负载和释放都有一定的影响，对样品的比表面积和孔径分布进行了测试，结果发现：0.1VC-CPSs和CPSs颗粒具有较发达的中孔(2-50 nm)和大孔，比表面积为 83.35 m²/g；2VC-CPSs颗粒的孔尺寸约为11 nm，具有大量的微孔，所以该样品比表面积较大，为95.87 m²/g；4VC-CPSs颗粒的比表面积最小，为77.64 m²/g，这可能是由于4VC-CPSs颗粒尺寸较大，而却只有少量微孔和较多大孔所导致；CPSs颗粒具有较多平均尺寸约为13 nm的微孔，比表面积为89.82 m²/g。通常情况下，载体的比表面越大负载的药物量越多。

2.4 载药量检测结果利用差重法检测了3种颗粒上所负载的维生素C量，其中2VC-CPSs样品具有较高的载药量，负载率高达(87.2±1.2)%；0.1VC-CPSs样品的维生素C负载率小于2VC-CPSs，为(59.9±5.4)%；4VC-CPSs样品负载率最低，为(28.4±26.3)%。药物负载率不仅与颗粒对维生素C的吸附量有关，还与颗粒表面和内部的孔结构有较大的关系。2VC-CPSs具有较发达的微孔，比表面积大，这种结构适合于包载和吸附维生素C。而0.1VC-CPSs样品具有较多中孔和大孔，比表面积小，表面吸附的药量也较少。4VC-CPSs样品表面大孔明显，比表面积最小，载药率不足。因此3种样品中，2VC-CPSs样品具有最高的载药量。

2.5 磷酸钙对维生素C控释的能力结果如图3所示，0.1VC-CPSs和2VC-CPSs的前期释放速率较慢， 4VC-CPSs前期释放速率较快，3种样品都有持续释药的特点。药物释放前12 d内，0.1VC-CPSs样品的释药速率为2.597 μg/d，随后的27 d内，速率增加到8.82 μg/d，之后释药速率急剧减少至0.44 μg/d；而2VC-CPSs样品前12 d的释药速率为74.4 μg/d，随后的45 d内药物较稳定地从载体中释放出来，其释药速率为147 μg/d，近2个月后速率减小为60.57 μg/d；4VC-CPSs样品释药前期没有出现较慢释放的现象，而是以约127.9 μg/d的释药速率持续释放了33 d，随后速率降为21 μg/d。所得到的磷酸钙颗粒对维生素C具有持久的控释能力，可能是由于维生素C与磷酸钙的羟基之间生成了氢键。但3种颗粒的药物释放率较低，均在55%以下，这可能是由于释药过程在常温常压环境中进行，对负载的维生素C的稳定性产生了影响，部分维生素C被氧化失效所导致。

2.6 超声处理下磷酸钙对维生素C控释的能力以具有最高药物负载率的2VC-CPSs样品为载体模型，探索了超声处理对药物释放的影响。由图4可知维生素C存在一定的突释现象，第1次释放量为5%-15%，而随后的释放速度较缓慢。在75，105，150 W超声辅助条件下，分别持续释放了220，340，260 min。计算可知，当超声功率为75 W时，药物平均释放速度约为16.36 μg/min，约180 min后，药物平均释放速度急剧减小为约7.7 μg/min；当超声功率增加至105 W时，药物平均释放速度增大到22.46 μg/min，持续释放了240 min后才减小为约4.62 μg/min；当超声功率为150 W时，由于首次突释较多，其药物稳定释放平均速度反而减小到了 17.11 μg/min，且在250 min时释放速度就急剧减小。在3种功率超声作用下，药物释放总量不足45%。

2.7 载药磷酸钙对细胞增殖与分化的影响结果在与样品共培养不同时间后，细胞的增殖情况见图5所示。共培养1 d后，CPSs和2VC-CPSs样品中的细胞数量与空白对照组基本相同；随着共培养时间的延长，样品组中的细胞数量明显增多，但与对照组相比没有明显差异，说明样品对细胞的增殖没有明显负面影响，具有良好的细胞相容性。

与样品共培养一定时间后，对细胞的碱性磷酸酶活性进行了测定，结果见图6所示。碱性磷酸酶检测结果表明2VC-CPSs样品与对照组间均有显著性差异(P < 0.05)，载有维生素C的磷酸钙培养的细胞碱性磷酸酶活性比纯磷酸钙有明显提高，而纯磷酸钙与纯血清培养的细胞碱性磷酸酶活性差异不明显。这表明载有维生素C的磷酸钙材料提高了成骨细胞的分化，而且这种促进作用随着共培养时间的延长而增大。该结果充分证明了维生素C在载体材料中的药物活性被较好的保存下来^[16-17]。

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引言

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年12月完成，材料制备及性能表征在浙江省立同德医院完成，体外细胞实验在浙江省中医药研究院完成。

1.3 材料维生素C购自西格玛奥德里奇有限公司(纯度≥99%)；NaCl、NaHCO₃、KCl、KH₂PO₄、HCl、CaCl₂，Na₂HPO₄•12H₂O、氨水、无水乙醇、硫酸钠和三(羟甲基)氨基甲烷等，均为分析纯，购自杭州米克化工仪器有限公司；MC3T3-E1细胞购自中科院上海生科院细胞资源中心；DMEM高糖干粉和L-谷氨酰胺购自GIBCO公司；优级胎牛血清、青/链霉素液、胰蛋白酶粉、二甲亚砜等购自上海申能博彩生物科技有限公司；MTT试剂盒、碱性磷酸酶活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；X-射线粉末衍射仪(ARL X’TRA，美国 Thermo Electron公司)；S4800场发射扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)；酶标仪(BIO-RAD Model: 680酶标仪，苏州净化设备有限公司)；KQ 3200 DB数控超声仪(中国昆山市超声仪器有限公司)；F-Sorb 3400比表面积及孔径分析测试仪(金埃谱科技有限公司)；紫外分光光度计(DU530，美国 Beckman公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 磷酸钙颗粒的制备及维生素C的负载实验在常温常压下避光环境中进行。首先，将浓度为0.1 mol/L的维生素C溶液滴加入CaCl₂水溶液中，搅拌30 min后，用1 mol/L NH₃•H₂O调节溶液pH为9.5，继续搅拌2 min；在功率为 100 W的超声条件下，向锥形瓶中滴入Na₂HPO₄溶液，继续搅拌2 min，得到白色悬浊液。在此反应终体系中，钙离子浓度为5 mmol/L，磷酸根离子浓度为3 mmol/L。维生素C在体系中的终浓度分别为0.1，2，4 mmol/L。将所得到的白色悬浊液在8 000 r/min离心8 min，取沉淀物冷冻干燥48 h即得载药样品。将制得的3种载药颗粒对应于维生素C的浓度分别命名为0.1VC-CPSs、2VC-CPSs和4VC-CPSs。按照上述反应步骤在无维生素C参与的反应体系中制备得到的磷酸钙颗粒被作为空白样品，命名为CPSs。

1.4.2 材料表征采用X-射线粉末衍射仪对制得的样品和纯维生素C进行成分和结晶度的分析。以CuKa射线 (λ=0.154 056 nm)为靶材，管电压40 kV、管电流35 mA、步长0.04°、扫描速度为5.0(°)/min的条件下，记录2θ=10°-90°的衍射强度曲线。制备实验结束时，将样品滴加到表面平整的硅片上，室温风干后采用S4800场发射扫描电子显微镜观测样品的微观形貌，电压1 kV。利用氮气吸附-脱附原理，在F-Sorb 3400比表面积及孔径分析测试仪上测试样品的比表面积和孔径分布。

1.4.3 维生素C的释放载药样品的药物释放过程在模拟体液中进行。模拟体液的配置方法参照文献[14]进行，模拟体液的成分及其与人体血浆的离子浓度对比见表1。

取载药颗粒0.06 g分散于15 mL模拟体液中，于25 ℃条件下缓慢搅拌，每隔3 d将悬浊液在8 000 r/min离心8 min，取全部上清液，经0.22 μm孔径的滤膜过滤后，用紫外分光光度计测溶液的吸光度(λ_max=265 nm)，对照维生素C的紫外吸收标准曲线，检测上清液中释放出的维生素C含量。向上述离心得到的沉淀中加入新鲜模拟体液15 mL，继续在相同条件下搅拌，隔3 d测其上清液中的维生素C含量。将此操作反复多次，测得不同时间的累积释药量，直至释放药量接近零为止。每个样品设置3个平行样。

为了探索超声对药物释放的影响。在超声环境下，利用上述方法重复药物释放实验。超声功率分别选取为75，105，150 W。超声处理悬浊液3 min后，离心取上清液，分析上清液中维生素C含量。向上述离心得到的沉淀中加入新鲜模拟体液15 mL，每次间隔20 min。如此反复，测得不同时间的累积释药量。每个样品设置3个平行样。

1.4.4 细胞实验

细胞培养：选取MC3T3-E1细胞作为骨相关细胞模型。细胞培养方法参照文献[15]进行。具体为：先从液氮罐中取出MC3T3-E1细胞冻存管，迅速放入37 ℃水浴环境中轻轻摇晃，直至冻存液完全溶解。从37 ℃水浴中取出冻存管，用乙醇擦拭管身和管口，在酒精灯下打开，用吸管吸取细胞悬液，加入灭好菌的离心管中，再缓慢加入10倍以上体积的培养液混合，800×g 离心5 min后去上清。然后加入适量培养液，悬浮后接种于培养瓶。37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度条件下培养，第2天换液后继续培养。通过显微镜观察，当细胞生长至铺满培养瓶底时进行传代培养从而获得所需量的细胞。吸去旧培养基，使用较少量PBS冲洗瓶壁后，加入0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻转动培养瓶，使消化液铺满所有细胞表面，然后盖紧瓶口，放入CO₂培养箱，继续消化2 min左右。通过倒置显微镜观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大时加入含血清的完全培养液终止消化。用吸管吹打瓶壁，使细胞完全脱落。最后在800×g离心5 min，放弃上清后加入适量培养液悬浮细胞制成细胞悬液。实验采用血球计数法进行细胞计数。

称量CPSs和2VC-CPSs样品各0.06 g，平铺于96孔板孔底，与细胞共培养，接种细胞浓度为1×10⁸ L^-1，加入胎牛血清。将细胞接种于空白孔板中，作为对照组，命名为Con。

细胞增殖评价：采用四唑盐比色法(MTT法)进行。将样品与细胞共培养1，3，5，7 d后，每孔加入1 mL无血清培养液和100 μL MTT贮存液(5 g/L)，37 ℃培养箱中继续培养4 h，在此过程中有紫色物质形成。小心吸取培养液，加入300 μL DMSO，使紫色沉淀全部溶解，取200 μL溶解液转入96孔板中，酶标仪测定其在570 nm处的A值。

碱性磷酸酶活性评价：按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行。将样品与细胞共培养1，5，10，15 d后，用吸管将上清液取出并稀释，按照试剂盒说明书测定各孔碱性磷酸酶活性。用分光光度仪在520 nm处测量A值，进行定量分析。

1.5 主要观察指标负载维生素C磷酸钙颗粒的载药及控释能力，以及对细胞增殖及分化的影响。

1.6 统计学分析采用SPSS10.0统计软件，所有实验设置3组平行样，实验结果用均值±标准方差表示，组间比较用单因素方差分析。P < 0.05时认为两组数据差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

因羟基磷灰石成分与天然骨组织相似、具有良好的吸附性、生物相容性和骨传导性，以及可被应用于骨组织药物载体和骨填充等生物医学领域而受到广泛关注。各国学者应用各种方法将其单独或与其他材料复合，作为抗生素、抗炎药、生长因子和多肽类药，如α-干扰素、布洛芬、生长因子和血清蛋白等的载体，以实现对药物保护和缓释的目的^[18-23]。此外，作为药物载体，不同形貌和表面性能的羟基磷灰石材料对于不同药物分子包载性能影响的研究也是目前研究的热点。

研究利用声化学的方法简单快捷地合成出多孔纳米磷酸钙球状颗粒^[24]。在此合成过程中，维生素C既是需负载的药物，也起到了表面活性剂的作用^[25]。当溶液pH>4.17时，溶液中的维生素C(pK1=4.17)会形成带负电的维生素C阴离子，当它被加入到富含钙离子的溶液中时，会因静电作用首先与钙离子结合，随后钙离子在碱性条件下与加入的PO₄^3-形成磷酸钙沉淀，并将维生素C包载于其中。同时，由于颗粒形成初期纳米磷酸钙颗粒比表面积大、表面原子数多、表面无序态及表面原子配位不饱和性导致大量的悬空键和不饱和键等，这使得纳米粒子具有极高的表面活性，可将维生素C吸附在其表面。因此利用此方法可以制备得到载有维生素C的多孔磷酸钙纳米颗粒。

由实验结果可知：所制备的3种颗粒均具有一定的载药率，其中2VC-CPSs样品的载药率最高，为(87.2±1.2)%。这不仅与颗粒对维生素C的吸附量有关，还可能与颗粒表面和内部的孔结构有较大的关系。如前所述，2VC-CPSs具有较发达的微孔，比表面积也较大，这种结构适合于包载和吸附维生素C，使维生素C较多地存在于载药颗粒内部微孔和中孔中，也较多吸附在颗粒表面。而0.1VC-CPSs样品具有较多中孔和大孔，比表面积小，平均孔径为15.35 nm，也较2VC-CPSs样品大，中孔和大孔可能不适合于对维生素C的包载，而由于其比表面积小，表面吸附的药量也较少。4VC-CPSs样品只有少量微孔和中孔，颗粒表面大孔明显，比表面积最小，载药率不足。因此3种样品中，2VC-CPSs样品具有最好的载药率。

在静态药物释放实验中，3种载药颗粒都有较持久的药物释放性能。药物释放性能与药物在载体上的结合牢度和存在状态有关，药物与载体材料之间的附着力越强，药物打破这种物理附着所需要的时间就越长，如果药物与载体之间产生化学键合，则若要使药物得到释放就需要更大的外界驱动力或者更长的时间。而这种载体对维生素C具有持久的释药时间，可能是维生素C与磷酸钙较丰富的羟基之间生成了氢键。存在于载体表面的药物或与载体作用力较弱的药物较容易脱离载体而释放出来，存在于载体内部和较曲折孔中的药物较难得到快速释放。从3种药物载体的缓释曲线可以看出，在药物释放早期，0.1VC-CPSs样品释放速度最慢，2VC-CPSs样品其次，4VC-CPSs样品速度最快，说明0.1VC-CPSs样品表面吸附的维生素C量较少；而4VC-CPSs样品表面吸附的量很多，4VC-CPSs样品表面多大孔的形貌也使得维生素C易于吸附与沉积，故该样品表面存在较丰富的维生素C，而另两种载体表面的维生素C就不如它多。经过12-15 d的缓慢释放阶段，0.1VC-CPSs样品和2VC-CPSs样品释放速率明显加快，这可能是磷酸钙内部孔中载有的维生素C在搅拌条件下缓慢地释放出来，而由于0.1VC-CPSs样品平均孔径较2VC-CPSs样品大，暗示前者内部孔径可能较大，使其释放速度得到加快，而因4VC-CPSs样品前期释药量大，其累积释药率一直较另两者大，直到药物接近释放完全。如前所述，2VC-CPSs样品具有较发达的微孔，这种微孔较适合包载小分子量的维生素C，对维生素C起到了一定的保护作用。这使得维生素C从2VC-CPSs样品中释放出来持续了两月余。但三种载体的药物释放率较低，均在55%以下，这可能是由于释药过程在常温常压恒氧的环境中进行，对载药粒中维生素C的稳定性产生了影响，部分维生素C被氧化所导致。

超声辅助药物释放在目前的医疗行业已被广泛应用，它能增加药物在特定部位的释放量，有一定的靶向作用，减少了药物浪费和药物对其他组织器官的毒副作用，而且一定功率的超声处理对人体正常组织没有伤害。研究载药颗粒在超声辅助作用下有持续释放药物的特点，说明维生素C并不是单纯地被吸附在颗粒表面(这会导致颗粒的释放速度无法持续)，颗粒也不存在较大的中空结构(这将导致药物释放速度的突然增大)，而是维生素C被较均匀地包载在球体的多孔结构中，由于超声对多孔结构的逐步破坏从而导致药物的可控释放。虽然三种载药样品在超声辅助释放早期药物释放速率没有较显著性差异。但就其平均释放速率而言，超声功率越大，药物释放速率越快。

在超声环境中，2VC-CPSs样品首次释药有突释现象，而4VC-CPSs样品首次突释现象更明显一些，与静态释药结果一致，也是由于这两者表面附着有较多维生素C的缘故。对于0.1VC-CPSs样品，没有首次突释药物的现象，随着超声功率从75 W增大到150 W，其释药速率也增大，这是由于超声功率越大，就越能破坏载体的多孔结构，使药物释放出来。而对于2VC-CPSs样品，因为比表面积大，表面吸附了一定的维生素C，所以存在一定的突释，又因其微孔多，相对而言，在相同超声功率条件作用下，大孔较易被破坏，中孔次之，微孔最不易受损；对于同一类孔，功率越大越易使孔破坏。而维生素C较多存在于该样品的微孔中，因此其药物释放速率较低，释放时间也较长。从4VC-CPSs样品超声辅助释放曲线图上可以看出，存在于该样品表面的维生素C较存在于其内部孔中的维生素C要多，首次平均释药率近30%，而随后的累积释药总量才不足20%，这也说明材料大孔较易受破坏，从而使维生素C释放出来。

在生理环境中，维生素C以阴离子的形式存在，它能保护内皮细胞免被氧化^[26]，也能促进软骨钙化^[27-29]，是造骨细胞标记物表达和矿化所必需的化学物质，还能够促进原骨胶原mRNA和胶原蛋白的合成。在细胞实验中发现，共培养1 d后，在2VC-CPSs样品上培养的细胞增殖较CPSs样品和空白样都有显著性差异，表明2VC-CPSs样品具有促进成骨细胞增殖的作用。共培养3 d后，2VC-CPSs样品对成骨细胞增殖的促进作用明显比CPSs样品强(P < 0.05)。因此，细胞增殖实验表明，2VC-CPSs样品比纯磷酸钙更能促进成骨细胞增殖。该结果也进一步证实利用此方法制备的多孔磷酸钙颗粒适合用作维生素C的载体，可实现对维生素C的负载、保护和控释的作用。

实验以超声辅助的化学共沉淀法成功制备了载有维生素C的多孔磷酸钙纳米颗粒。反应体系中存在的维生素C即可调节磷酸钙颗粒的尺寸和孔结构，还可被负载在磷酸钙颗粒上，实现其持续、可控释放，且释放时间可长达一两个月。此外，超声处理可以加速维生素C的释放，加速幅度可以通过改变超声功率的大小而加以调节。所制得的负载有维生素C的磷酸钙颗粒具有明显促进成骨细胞碱性磷酸酶活性表达的作用，在骨组织修复领域内具有很好的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程